睾丸移植的昨天今天明天

摘要: 睾丸移植技术是治疗高位腹腔型隐睾、男性性腺功能减退和男性不育重要而有效的方法。19世纪初至今, 在自体移植,同种异体移植，Leydig细胞移植等方面已取得较大进展，本文结合近年来的相关文献报道，就睾丸移植的研究进展进行综述，对精原干细胞移植这一新近研究热点进行介绍。并就睾丸移植技术带来的论理学问题加以讨论。

关键词: 睾丸 移植 精原干细胞

Abstract: Testis transplantation is an important and effective way to treat abdominal impalpable cryptorchidism，male hypogonadism and male infertility．Since 1990s a lot of advances have been made in autotransplantation，homotransplantation and Leydig cell transplantation and so on．The advances in testis transplantation are summarized in this paper based on the related literature of recent years. Spermatogonial stem cell transplantation is introduced as the new treatment method ,while the ethnics problems on testis transplantation are also disgussed in this review.

Key words：testis transplantation；testis; transplantation; spermatogonial stem cell

自从1912年，美国医生第1次对1名患睾丸癌的年轻病人进行生殖腺的移植。此后，睾丸移植技术经历了自体睾丸移植,同种异体睾丸移植和睾丸Leydig细胞移植及精原干细胞移植技术的几个阶段。现就睾丸移植方面研究的过去,现状及发展作一综述。

1976年,Silber等^[1]首先报道应用显微外科技术将1例位于腹膜后的高位隐睾移植至阴囊获得成功，此后该手术成为治疗高位腹腔型隐睾的经典术式，同时，该方法也适用于睾丸固定治疗法失败者。 同传统的睾丸分期固定术以及长袢输精管睾丸固定术相比，睾丸自体移植可以避免多次手术，既保存了精索血管，又可以通过精索血管提供血运，并将睾丸置入阴囊内，恢复正常生理外观，手术成功率明显提高，同时术后睾丸萎缩发生率大为降低。Oesterwitz H等^［2］综述245例自体睾丸移植患者。其成功率为87％，并强调血管吻合理想与否对其成败至关重要。血管吻合时，于吻合血管腔内填充支架，不但提高了吻合的准确性，缩短了手术时间。同时有助于避免损伤对侧血管壁，成为提高通畅率的重要方法.1998年Boeckx^[3]等对25例接受自体睾丸移植术治疗的腹腔型隐睾患者随访1年以上，成功率达96％。目前，高位腹腔隐睾的寻找与诊断已成为自体睾丸移植的关键性问题。西班牙学者Sanchez^[4]采用腹腔镜辅助进行了睾丸自体移植手术(1aparoscopically assisted testicular autotransplantation，LATA)，取得了较好效果，认为LATA是双侧腹腔型隐睾和对侧睾丸在固定术后发生萎缩的患者的首选术式。此后,随着超声波影象，磁共振成象、腹腔镜等检查配合诊断的开展,疾病诊断率已有明显提高。

1966年，Ataran等^[5]成功地在犬身上进行了同种异体睾丸移植术。 1971年，Lee^[6]描述了大鼠同种异体睾丸移植模型建立方法，并证实移植后短期内能维持正常的FSH和LH水平。1978年Silber^[7]成功地将1正常男性睾丸移植到他的无睾症的双胞胎兄弟阴囊中，2年后患者之妻产1健康男孩。在我国，王玲珑、詹炳炎^[8]等于1984年最早为1例双侧外伤性无睾症患者采用其父的供睾行同种睾丸移植术.术后睾丸存活，血清睾酮上升至正常值，术后5年生育1男孩。随后该手术及试验研究在全国各地相继开展起来。此手术主要适用于先天性或外伤性无睾症患者，双侧严重睾丸萎缩或先天性双侧睾丸发育不良(小睾丸)伴有血中睾酮极度低下者以及双侧腹腔型隐睾行睾丸固术或自体睾丸移植术致睾丸萎缩或坏死者。但是，植睾生精功能不理想以及由此带来的论理学困惑等诸多问题限制了同种异体睾丸移植的临床应用。

目前认为影响异体睾丸移植术后生精功能的因素主要有: ①睾丸缺血时间。Goldstein^[9]等研究认为植睾功能受损与缺血时间长短有关，90分钟冷缺血的植睾组织学变化与热缺血20-30分钟相似，对缺血所致的损害低温并不具有完全的保护作用。Attaran^[10]等研究认为同种睾丸移植成功的基本决定因素是缺血时间，超过2小时就不理想。②血管及输精管吻合质量的好坏也直接影响到移植术后植睾及植睾附属器官的存活、功能、形态 ，进而影响到精子的存活与质量。③HLA配型。有文献显示，亲属供睾术后排斥反应发生率较低，其受者精液中发现精子的可能性要高于尸体供睾者。④术后排斥反应.睾丸移植后排斥反应发生率一般在50%左右。有学者发现术后本来有生精功能者，一旦出现排斥反应则立即丧失生精功能，因而指出预防术后排斥反应是保持移植睾丸生精功能的关键。确诊后经激素冲击治疗效果明显,移植术后应用免疫抑制剂对控制排斥反应、维持移植睾丸正常功能也具有重要作用，关键是引起足够重视。⑤缺血再灌注损伤。Koji^[11]等研究发现睾丸发生缺血再灌注损伤时Fas/FasL系统在精子细胞的表达增加，并介导了睾丸生精细胞的凋亡过程。如果应用Fas抗体阻断Fas与FasL的结合，同时使用氧自由基清除剂和钙离子通道拮抗剂，对防止再灌注损伤，减少精原细胞凋亡，最终提高植睾丸生精能力有重要意义。

近来研究显示胚胎组织除具有较强的耐缺血缺氧能力外，还具有免疫宽容性，胎儿睾丸移植的研究已引起众多学者的关注。美国学者Statter^[12]等进行胎鼠睾丸同种异体移植获得长期存活，证实睾丸免疫宽容现象存在。这种免疫宽容与精于发生和生发上皮没有关系，而是通过抑制T淋巴细胞和B淋巴细胞增殖反应减少巨噬细胞和淋巴细胞的浸润，睾丸酮和Leydig细胞分泌的前列腺素也对抑制免疫反应起调节作用。1997年至2000年间,胡云飞等^[13]为6例男性性腺功能减退症患者施行了胎儿睾丸移植术,5个月后随访,男性第二性征、性欲及性功能均有改善，血清睾酮明显升高。提示胎儿睾丸在受者体内能有效分泌雄性激素，并发挥生理功能，这为胎儿睾丸移植展现了极好的应用前景。随着胎儿睾丸组织在受者体内不断发育成熟，受者是否有可能获得生精功能尚需进行远期观察。

睾丸Leydig细胞分泌的睾酮约占血浆睾酮的95％，为此人们寻求利用睾丸Leydig细胞移植来治疗男性低睾酮血症的方法.1989年Joseph^[14]介绍了纯化Leydig细胞的方法，并将其移植于近交系大鼠腹腔内，移植后90天，睾酮水平明显高于对照组，并希望以此给许多低睾酮血症患者提供一种符合生理节律、副作用小的激素补充治疗。 Lee Ms^[15]等进行动物实验发现，睾丸间质细胞自体移植于肾包膜下或腹膜腔的睾酮水平高于皮下或阴囊睾丸床移植，通过增加移植细胞数量或者利用摄取胶原，睾酮产生量可增加到生理范围。从睾丸组织中分离Leydig细胞．再用Percoll提纯后移植，其效果较睾丸组织匀浆移植为好，血清睾酮值升高时间明显延长。高新、钱辉军等先后针对大鼠和人睾丸Leydig细胞培养传代、冷冻保存、同种移植以及人睾丸Leydig细胞HLA抗原表达等进行观察，结果说明：(1)大鼠及人的Leydig细胞体外培养均保持分泌睾酮功能达20天；培养后细胞纯度达95％±3.2％；人胚胎睾丸Leydig细胞接种后，贴壁、增殖、达平顶期及细胞汇合均较成人Leydig细胞早，分泌睾酮值也高于成人。(2)同种Leydig细胞移植后均不用免疫抑制剂，术后血清睾酮值均明显高于阴性对照组，有些病例(6／9)血睾酮值达正常，性功能有不同程度的改善。(3)成人睾丸Leydig细胞、生精细胞及支特细胞均未发现HLA抗原表达^[16]。上述结果提示，提示睾丸Leydig细胞移植是一种有效的治疗男性性腺功能低下的新方法。低温冷冻储存的发展更为Leydig细胞的长期保存提供了重要的技术支持。

自20世纪80年代微囊技术开始应用于缓释药物治疗糖尿病、多种系统肿瘤、器官衰竭和中毒等疾病，取得良好效果。在此启发下，李爱林等^[17]利用微囊具有较好的免疫隔离作用，将大鼠Leydig细胞微囊化后异种移植到小鼠腹腔，结果显示微囊对睾酮有良好的通透性，微囊内Leydig细胞对人绒毛膜促性腺激素(HCG)有良好的反应性。术后30天血中睾酮值明显升高，术后60天开始降低。Leydig细胞微囊化的研究为临床开展异种Leydig细胞移植提供了理论依据，增加了睾丸间质细胞移植的来源和手段。但是术后血T维持时间较短，而且生精功能恢复不理想，限制了其进一步的发展。

1994年，Brinster等^[18]首次报道利用显微注射技术将可育小鼠的精原细胞混悬液注射到不育小鼠睾丸生精小管内，成功地恢复了受体的精子发生，引起人们的广泛关注。在国外，SSC移植已发展为同种细胞移植、异种细胞移植、冰冻细胞移植、纯化细胞移植等多个领域。

小鼠间同种细胞移植已经获得成功，将不育小鼠的SSC移植入正常小鼠体内，供体细胞口可以在受体内出现精原细胞分化，产生精子，而将正常小鼠的SSC移植入不育小鼠体内，供体细胞同样可以产生精子。Honmamooz^[19]在实验中，将猪的生殖细胞植入自身对侧的睾丸(自体移植)和无关的受者睾丸中(同种异体移植)，发现两者也都未对供者的生殖细胞发生明显的免疫应答。

1996年Brinster实验室的Clouthier等^[20]在国际权威杂志《Nature》上报道，他们成功地进行了异种动物间的移植，通过显微注射将转基因Sprague-Dawley供体大鼠的SSC注入免疫缺陷受体小鼠，可以见到标记细胞在小鼠睾丸组织内生长，在移植数月后在小鼠附睾内发现具有大鼠精子头部形态特征的大鼠精子。但近来有学者将兔、狗精原干细胞移植于免疫缺陷小鼠睾丸中，植入的SSC可使宿主曲精小管的基底部分细胞群恢复，但不能进行分化，精子发生也无法完全恢复^[21～23]。

相似的情况也发生在人SSC植中。近来有学者^[24]已将从阻塞性无精症和精子发生障碍的6例患者睾丸活检中获得的生殖细胞移植于小鼠22个睾丸内，观察6个月显示在16个小鼠睾丸曲精小管基底部存在人SSC克隆，但未见分化型精原细胞，也未见减数分裂的发生，仅在移植后1月内可见到生殖细胞的扩增。具体的原因尚不清楚,有待进一步的试验和研究。

除新鲜移植SSC外，学者们还对冷冻SSC移植进行了研究。动物实验发现，冰冻保存后的精子细胞，很难与卵细胞受精，但是冰冻保存后的精原细胞可以在供体组织内分裂分化产生精子^[25]，将－196℃保存4～156天的SSC移植人小鼠睾丸组织，可以看到精子发生。最近的一项针对5-7个月小牛睾丸A型精原细胞低温保存方法的研究显示，应用含有10%胎牛血清, 10%二甲基亚砜（DMSO）和0.07M蔗糖的MEM培养基，以非控制性缓慢速度降温冻存细胞的方案可获得接近70%的活细胞^[26]。动物实验还发现，将冷冻的精原干细胞复苏后再注入受者自身睾丸能够继续发育成为成熟的生殖细胞^[27],但某些物种则不能。可能是由于细胞毒性的作用破坏了精原干细胞和内环境之间的平衡。不幸的是，任何一种物种目前都未获得子代的报道。因此,精原干细胞冷冻－复苏移植是研究的热点之一。如果能获成功，青春期和青春期前的男性肿瘤患者将受益非浅。

纯化干细胞是否可以提高移植的成功率？1999年Shinohara等^[28]利用抗基底层干细胞表面蛋白质的抗体进行实验后证明，注入的供体细胞中如干细胞含量增加10倍，受体“移民”生精细胞的数量也增加10倍。Dirami等^[29]通过速度沉淀并用差异性粘附清除Sertoli细胞的方法;Brook等^[30]应用密度梯度离心法和离心淘析法; Shinohara等应用包被c—kit抗体的免疫磁珠法^[31]和实验性隐睾技术^[32]，富集纯化的精原干细胞先后获得成功。分离纯干细胞是提高移植效率的最佳途径, 另一个重要途径就是要确定注人细胞的最适数量.Dobrinski等^[33]首先利用图象分析系统研究了在不同数量供体细胞注入受体睾丸后细胞移植的效果，最后他们建议每只受体睾丸注人大约10⁷的供体细胞.另有实验显示，低水平睾酮有利于提高移植效果。

在睾丸移植中，如果单纯为了解决内分泌功能，目前采用的睾丸Leydig细胞移植是一种很好的方法，该方法能够满足受体对雄性激素的需要,且一般不会涉及血缘关系和辈分的改变，因此在伦理上不会引起多大的争议；但是要解决生育问题，就存在一个不可缺少的环节，即从一个人身上(包括活体或新鲜的尸体)取得能够成活的睾丸或睾丸组织移植给另一个人。而这一行为一直是伦理争论的关键和热点。首先是血缘关系的混乱。子代的父亲是供睾者还是受术者的问题将直接导致子女与父亲的关系陷入一种混乱状态;而且如果供体是受体的长辈，那么所生的后代在遗传学上应该是受体的长辈或同辈，但是在社会角色上仍是子女，这就必然会引起子代与亲代辈份的错乱。同时，植睾供体和受体的选择，睾丸移植术的实施也必须满足论理学及医学原则，并且需要综合考虑到各项社会因素的影响。睾丸移植不是单纯的医学技术问题，而是深深牵动家庭和社会伦理的复杂问题；它不仅有赖于人们伦理观念的更新，而且也需要相关立法的支持和保障才能有效解决。

综上所述，睾丸移植在不同领域都取得了较大进展。血管吻合质量的提高，新型免疫抑制剂对排斥反应有效的控制及药物睾丸毒性的减少等研究的深入，为解决同种睾丸移植术后生精功能不良的难题提供了可能，然而该技术的长远发展还有赖于伦理观念的更新及相关立法的完善。Leydig细胞移植在恢复患者的第二性征、提高雄激素水平、改善性功能方面已取得了较为满意的效果，但术后血T维持时间较短以及生精功能不良限制了进一步的发展。精原细胞移植技术作为近来研究的热门，为干细胞及其微环境的研究提供了一个重要的功能检测系统，为雄性生精细胞生物学研究开拓了新的广阔空间。结合冷冻保存及体外培养技术，精原干细胞移植技术将在保护有特殊价值的基因物质，转基因家畜生产以及保存青年男性肿瘤患者生育能力等方面做出更大的贡献。