阿德福韦酯相关性HBV潜在耐药变异位点研究进展

阿德福韦酯对慢性乙型肝炎（慢乙肝）患者感染 的 HBV 野生株及拉米夫定耐药株均有效，患者接受阿德福韦酯治疗 1、2、3、4、5 年 HBV 累积耐药率较低，分别为 0%、3%、11%、18%、29%。每天口服 10 mg阿德福韦酯不良反应的发生率与安慰剂相当，而且其价格相对较低。阿德福韦酯曾是我国治疗慢乙肝的一线药物之一。但是，同其他核苷（酸）类似物（拉米夫定、替比夫定和恩替卡韦）一样，阿德福韦酯只能抑制HBV 复制而不能将其清除，由此决定了阿德福韦酯抗HBV的治疗是一个长期的过程，长期治疗最困扰临床医生的是可能导致的HBV耐药问题。有报道显示，HBV对阿德福韦酯耐药与病毒学反弹以及发生致命性肝脏失代偿性疾病密切相关。最近研究报道，由于HBV S 区完全嵌合于 P区，HBV rtA181T位点变异会导致S区相应的sW172 位点变异，该位点变异株具有分泌失活效应，使得 rtA181T/sW172 突变株滞留于肝细胞中，从而存在潜在的致瘤作用；而且，rtA181T 位点变异对应 S 区 sW172 位点变异，会导致已经获得免疫力的机体发生免疫逃逸，进而引发严重的公共健康问题。因此，早期全面评估阿德福韦酯相关的耐药问题，对指导临床采取合理的补救治疗措施至关重要。目前认为，阿德福韦酯的作用靶点为HBV保守的反转录酶段，故此段的位点变异可能会导致变异株 对阿德福韦酯耐药。现将目前研究较多的与阿德福韦酯相关的HBV耐药变异位点进行概述。

1.经典耐药变异位点（rtA181V/T 和 rtN236T） HBV 第 236 位点的天冬氨酰被苏氨酸所替代 （rtN236T）首先于2003 年美国肝病年会由 Gilead公司报道，并证实该位点变异与HBV 对阿德福韦酯耐药相关。随后证实与阿德福韦酯相关的 HBV 耐药位点为 rtA181V/T，即 HBV 反转录酶段的第 181 位点的丙氨酸被缬氨酸/苏氨酸所替代。目前 rtA181V/T 和 rtN236T 两位点变异是公认的与阿德福韦酯相关的耐药变异位点。有学者等通过对 4 个阿德福韦酯治疗的慢乙肝患者 HBV 聚合酶段的氨基酸变异进行分析后认为，慢乙肝患者接受阿德福韦酯治疗后出现病毒学反弹仅仅与 HBV反转录酶段的 rtA181V 和 rtN236T 两位点变异有关。

但是临床实践发现，部分慢乙肝患者接受阿德福韦酯治疗过程中，直接反映病毒复制水平的HBV DNA 滴度长期不能降至检测下限，下降水平不理想或出现病毒学突破，而相应PCR产物经直接测序检测却并未发现明显的 rtA181V/T 和（或）rtN236T 位点变异株；再者，由于HBV的聚合酶/反转录酶本身缺乏校正功能，从而导致 HBV 的突变率较一般的 DNA 病毒高。

而也有学者也认为，相对于未能有效抑制HBV DNA复制的患者来说，在 HBV DNA出现突破的患者中更有可能发现对阿德福韦酯耐药的变异株。因此，对于上述临床现象，在排除患者依从性差、药物吸收障碍等因素后，我们可合理推断除rtA181V/T和rtN236T两个位点变异之外，尚存在与阿德福韦酯相关的其他 HBV 耐药变异位点。

还有学者报道，除了 rtN236T以外，已经检测到其他与阿德福韦酯相关的HBV变异位点，其聚集在HBV反转录酶段的3个不同区域：D区和A区（rtP237H、rtN238T/D、rtV84M 和 rtS85A）、 B 区（rtA181T/V）、C 和 D 交界区域（rtV214-A、rtQ215S）。这些变异位点被定义为继发耐药变异位点。因为在体外这些变异位点仅仅与非常低的耐药水平相关，但在接受阿德福韦酯治疗无应答或出现病毒学反弹而无rtN236T位点变异株的患者中，这些变异位点可以被检测到。

体外抗病毒检测表明，rtV84M或rtS85A位点变异株对阿德福韦酯的敏感性降低，分子模型显示rtS85直接与ADV-TP的γ-三磷酸腺苷发生交互作用，若该位点变异则会阻止这种作用。

反转录酶区第215位点的谷氨酰胺被丝氨酸/脯氨酸/组氨酸所替代（rtQ215S/P/H）尽管 学者曾将rtQ215S 位点变异定义为HBV对阿德福韦酯的继发耐药变异位点之一，但另有研究认为，该位点变异更有可能是基因多态性的表现而非有临床意义的耐药变异。因为经体外试验分析后发现，该位点变异株的复制能力与野生株相当，而且这些位点变异株于体外对拉米夫定或阿德福韦酯治疗依旧敏感，所以认为尽管该位点变异于基因D 型HBV中发生率较高，但其既不会降低HBV的复制效率，也不会导致HBV对阿德福韦酯耐药。Arrese 等对 20 例慢乙肝患者的 HBV聚合酶区进行直接测序，分析后发现1 例对阿德福韦酯耐药的患者具有rtA181V┼rtQ215S联合位点变异。Sayan等在监测土耳其慢乙肝患者HBsAg变异及核苷（酸）类似物相关性耐药变异中发现，初治患者之前便存在核苷（酸）类似物相关性耐药变异位点，其中就有与 HBV对阿德福韦酯耐药相关的rtQ215S位点变异。 

反转录酶区第214位点的缬氨酸被丙氨酸所替代（rtV214A）2003年Westland等在一项阿德福韦酯的Ⅲ期临床试验中经过48周监测之后发现，1 例存在rtV214A位点变异株，但体外试验却发现该位点变异株对阿德福韦酯完全敏感。Pastor等报道了1 例未接受过阿德福韦酯治疗的慢乙肝患者 存在rtV214A/rtN238T 位点变异，基于另一项研究发现，他们认为从理论上说该位点变异会引起乙型肝炎初治患者对阿德福韦酯耐药。但由于所研究病例较少，再加上其他学者的研究发现，他们认为该位点变异的临床重要性尚须进一步研究探讨。 

反转录酶区的第 238 位的天冬酰胺被组氨酸/ 苏氨酸/天冬氨酸所替代（rtN238H/T/D） 目前对于 rtN238H/T/D 是否为 HBV 对阿德福韦酯的继发耐药位点同样存在不同的意见。Zhong 等对我国 1865 例慢乙肝患者进行研究后发现，165 例（8.8%） 患者存在 rtN238 位点变异株，其中 86.1%（142/165） 为 rtN238H 位点变异株；并且相对于基因 C 型HBV，即使在无外源性选择性压力的条件下，该位点变异株也更常见于基因 B 型 HBV 中。经体外表型分析发现，rtN238H位点变异株与野生株相比，二者的复制效率无明显差别，而且该位点变异并不影响HBV对拉米夫定或阿德福韦酯的敏感性。因此他们认为该位点变异更有可能是 HBV 基因多态性的表现，而并非有临床意义的耐药性变异。 

反转录酶区的第233位的异亮氨酸被缬氨酸所替代（rtI233V）目前对rtI233V位点变异与HBV对阿德福韦酯耐药是否相关存在几种不同的观点。Schildgen等2006年首次报道了3例对拉米夫定耐药的慢乙肝患者在接受阿德福韦酯治疗前便已存在rtI233V位点变异株，且在治疗中对替诺福韦应答而对阿德福韦酯无应答。经体外表型分析后，他们认 为该位点变异虽然比较罕见且与HBV的基因型无明显相关性，却可导致HBV对阿德福韦酯原发性耐药；之后，他们又进一步报道了2例慢乙肝患者在接受阿德福韦酯治疗后出现rtI233V位点变异株，并显示出阿德福韦酯治疗失败。同样，经过体外表型分析后，他们认为该位点变异虽然在接受阿德福韦酯治疗前比较罕见，但在接受阿德福韦酯治疗后，该位点变异存在于所有HBV亚群中，并在阿德福韦酯治疗过程中被选择出来，进而导致HBV对阿德福韦酯耐药。此外，尚有其他研究发现存在rtI233V位点变异。有研究通过对97例HBV感染的初治患者进行HBV RT区测序并与GenBank中的野生株HBV相应序列进行比对，筛选出4例阿德福韦酯相关rtI233V位点变异，认为该位点变异于基因D型HBV感染中相对常见，并且可影响阿德福韦酯的治疗效果，但该位点变异仅仅从侧面反映了HBV对阿德福韦酯耐药的一个反转录酶区变异位点，其对阿德福韦酯抗 病毒治疗的影响尚须进一步研究。Mirandola通过对286例慢乙肝初治患者的血清标本进行分析，筛选出13例的HBV变异与耐抗病毒药物相关，其中4例存在rtI233V位点变异株，并认为其可能会降低HBV对阿德福韦酯的敏感性。而Curtis从853例慢乙肝患者中筛选出4例具有该位点变异株的患者，通过对临床分离株及实验室株进行体外分析后，认为HBV rtI233V位点变异株在体外仍然对阿德福韦酯完全敏感，因此该位点变异与HBV对阿德福韦酯之间并无相关性。Tan等研究发现与Curtis的结论一致，认为rtI233V 位点变异并非HBV对阿德福韦酯应答不理想的关键因素，因为他们通过直接测序法发现其研究对象无一例出现该位点变异，且该位点变异也可从对阿德福韦酯不耐药的患者中被检测出来。 反转录酶区第118位点的天冬氨酰被组氨酸所替代（rtN118H）及第207位点的蛋氨酸被缬氨酸所替代（rtM207V） 曾爱中等从阿德福韦酯Ⅲ期临床试验中筛选出 30 例原发治疗失败或继发耐药患者，均未发现 HBV rtA181V/T 和 rtN236T 位点变异。 

反转录酶区第200位点的丙氨酸被缬氨酸所替代（rtA200V）Inoue报道了1例对拉米夫定耐药的慢乙肝患者在接受拉米夫定+阿德福韦酯联合治疗后出现病毒学突破，通过对该患者的HBV进行测序发现了rtA200V位点变异，并经体外表型分析表明该位点变异可恢复HBV rtL180M┼rtM204V位点变异株的复制能力，且该位点变异可独立于rtN236T 位点变异，足以导致HBV对阿德福韦酯耐药。 

反转录酶区第180位点的亮氨酸被蛋氨酸所替代（rtL180M）目前认为，拉米夫定相关性HBV经典耐药位点为 rtM204I/V±rtL180M，但最近有研究报道，rtL180M位点变异可能与 HBV对阿德福韦酯耐药密切相关。Lee等对97例拉米夫定耐药患者进行阿德福韦酯单药治疗并随访平均约13个月后发现：携带rtL180M位点变异株的患者相对于无该位点变异株的患者，出现病毒学突破的几率更高 （2年累积病毒学突破发生率为37% vs. 3%，P＜ 0.01）。经多变量COX比例风险分析，rtL180M位点变异是发生病毒学突破的独立性相关因素。因此，他们认为对拉米夫定耐药的慢乙肝患者在接受阿德福韦酯治疗过程中，rtL180M位点变异可能与HBV对阿德福韦酯耐药密切相关。但该研究未能观 察rtL180M与rtA181V/T之间的联系，由于该两位点相邻，不能排除二者之间的相互作用。因此，尚须进一步研究明确rtL180M与rtA181V/T之间是否具有内部联系，从而判定rtL180M位点变异与HBV对阿德福韦酯耐药的相关性。 

综上所述，rtA181V/T和rtN236T两位点变异与 HBV 对阿德福韦酯耐药的相关性目前得到共识，而其他变异位点与HBV对阿德福韦酯耐药关联性呈多样化、散在（rtI233V、rtQ215S、rtV214A、rtN118H、 rtM207V、rtA200V、rtP237H、rtN238H/T/D、rtV84M、 rtS85A 等）却又相对集中（主要位于 HBV 的 RT区），但这些变异位点的重要性却尚未完全明确。基于临床实践及HBV的特性，我们认为除了rtA181V/T和rtN236T两位点变异可导致HBV对阿德福韦酯耐药外，尚存在其他变异位点与HBV对阿德福韦酯耐药相关，但这些变异位点的重要性仍须大规模临床试验及体外表型分析证实。相信随着分子生物学等实验技术的进展，相关变异位点与HBV对阿德福韦酯耐药的关联性会进一步明确，从而有效地指导临床抗病毒治疗