乙型肝炎病毒DNA整合：肝细胞癌发生机制的新视角与生物标志物

乙型肝炎病毒（HBV）DNA整合是HBV相关肝细胞癌（HCC）发生的关键因素，为HCC治疗提供了新的生物标志物。本文综述了HBV整合诱导的插入突变、整合热点基因的激活、以及个体HCC中独特序列的病毒-宿主嵌合DNA（vh-DNA）作为监测残留HCC或新发复发的潜在生物标志物。

流行病学

肝细胞癌（HCC）是全球第六大常见癌症，尤其在亚洲和非洲地区，由于慢性乙型肝炎病毒（HBV）感染的高流行率，HCC的疾病负担尤为沉重。尽管自1986年以来，多数国家实施了HBV疫苗接种计划，显著降低了儿童和年轻成人中的HBV携带率，但HBV相关HCC的绝对病例数仅略有减少。因此，降低HCC的发生率成为慢性HBV（CHB）感染患者治疗的主要挑战。

慢性HBV感染与HCC的关系

慢性乙型肝炎（CHB）感染通过增加肝细胞癌（HCC）风险约10到30倍，与非HBV人群相比，显著促进了HCC的发生。在CHB患者中，男性携带者的终生患HCC风险约为30%，女性携带者约为10%。CHB通过直接和间接机制促进肝细胞的癌变，其中直接机制包括转化病毒蛋白如HBx或缺失的Pre-S，以及更重要的是HBV DNA在HBV相关HCC细胞基因组中的整合。尽管全基因组测序（WGS）鉴定了宿主基因的一些已知体细胞突变，但HBV DNA整合是HBV相关HCC中最常见的突变，大约90%的HBV相关HCC细胞含有整合的HBV DNA，通常位于多个染色体位点。

HBV相关HCC基因组中的体细胞突变：宿主基因和HBV DNA整合

HBV相关肝细胞癌（HCC）的基因组中的体细胞突变，这些突变包括宿主基因的突变和HBV DNA的整合。通过全基因组测序（WGS），研究者们发现了宿主基因中一些众所周知的体细胞突变，如TERT启动子的特定点突变，这在高达60%的非HBV相关的HCC中可检测到，在HBV相关的HCC中约为30%。然而，这些常见突变主要出现在HCC的早期或晚期。在肝硬化的微切割再生结节中（HCC的公认前体），并未发现这些常见突变，而是观察到不同单核苷酸位置上突变的增加。因此，早期或晚期HCC中发现的常见突变更可能是与初始驱动突变协同作用，促进癌症发展的突变。而HBV DNA整合是HBV相关HCC中最常见的突变，约90%的HBV相关HCC细胞含有整合的HBV DNA，通常位于多个染色体位点，这一发现强调了HBV DNA整合在HCC发生中的重要作用。

全面识别HCC中HBV DNA整合的平台

从经典的Southern blot到反转录聚合酶链反应（PCR），再到高通量测序（NGS）技术，如全基因组测序（WGS）、RNA测序（RNA-seq）和捕获测序（Cap-seq），这些方法在精确识别HBV整合位点方面取得了进展。WGS能够提供无偏的全基因组信息，但需要大量的测序数据来检测整个人类基因组中的HBV整合区域。RNA-seq则能够识别那些导致转录混合mRNA的HBV整合事件。Cap-seq利用基于HBV基因组序列设计的探针，通过捕获杂交富集含HBV的DNA片段，以较低的测序输出量高效读取连接DNA片段。此外，直接检测方法通过将测序读取映射到人类基因组和HBV基因组上，能够精确地识别整合位点。这些平台对于理解HBV DNA整合在HCC发展中的作用至关重要。

HBV相关HCC中的HBV DNA整合

HBV DNA整合数据库

包括三个关键的在线数据库：VISDB、ViMIC和VIS Atlas。这些数据库提供了HBV整合位点的详细信息，包括与肿瘤相关的基因状态、基因表达、miRNA相互作用、表观遗传学改变等。VISDB和ViMIC主要从已发表研究中提取信息，而VIS Atlas则提供计算得出的HBV整合位点，这些资源对于研究HBV整合对肝细胞癌发生的影响至关重要。

HBV DNA整合位点的一般特征

HBV整合是将病毒双链线性DNA插入人类基因组的过程，通常位于末端直接重复（DR）序列周围。HBV基因组经常发生复杂的重组或重排，但保持了如增强子区域的病毒启动子的完整性。

HBV DNA整合对致癌作用的证据

HBV DNA整合在HBV感染周期中是一个偶然事件，通常只出现在0.1%至1%的感染肝细胞中。然而，这些整合的肝细胞随着CHB患者年龄的增长逐渐克隆性扩展，形成了HCC的前体。在HCC阶段，HBV整合的比例显著增加至90%，表明含有HBV整合DNA的肝细胞在进展为癌症方面具有明显优势。此外，研究观察到HBV DNA在慢性乙肝肝组织中的整合是随机的，但在HCC组织中存在特定的整合热点，如TERT基因启动子和MLL4基因的外显子3-6，这些热点的出现暗示了在带有随机HBV整合的感染肝细胞库中存在正向选择。插入的HBV DNA可以通过病毒增强子和启动子上调下游人基因的表达，如在TERT启动子区域的HBV-TERT整合，导致TERT表达的激活，这对于癌症的发展至关重要。

来自个体HCC的HBV整合位点的特征性连接片段作为癌症或克隆性增生的生物标志物

HBV DNA整合位点在每个个体HCC中的具有独特性，这些位点可以作为癌症或克隆性增生的生物标志物。HBV DNA整合在个体HCC中的确切核苷酸序列（vh-DNA）是独特的，这些连接片段可以作为个体HCC的签名。通过比较手术后复发HCC与原发HCC的HBV DNA整合模式，可以确定复发HCC的来源。此外，这些连接片段可以作为循环中的无细胞肿瘤DNA（cfDNA），类似于其他癌症，它们可以被释放到血液中，为液体活检提供了新的方法。研究表明，通过特定的数字PCR技术，可以在HCC切除时检测到血液中的这些独特连接片段，并且它们的丰度与HCC的大小相关。这些发现为监测HCC切除后的残留疾病和预测HCC复发提供了新的生物标志物。

来自HBV整合位点的无细胞vh DNA是监测切除后残留疾病或追踪HCC克隆性增生的新生物标志物

通过循环无细胞连接片段监测HCC克隆性增生的前景

通过循环中的无细胞连接片段监测肝细胞癌（HCC）中的克隆性增生（CHIP）的潜力。研究提出了一个概念，即每个CHIP可能含有独特的HBV整合，这些整合的连接片段（vh-DNA）可以释放到血液循环中。如果能够提高捕获测序（Cap-seq）平台的灵敏度和特异性，以可靠地检测来自CHIP或早期/小HCC的罕见连接片段，那么将有可能实时监测这些克隆的进展，并为慢性乙肝患者从克隆性增生到HCC的过渡提供有用的新生物标志物。

结论

HBV DNA整合是HCC发生的关键驱动因素，提供了新的治疗靶点和潜在的液体活检癌症生物标志物。随着对HBV DNA整合在HCC中作用的进一步了解，可以开发更精确的HCC治疗方法，并为患者提供更好的临床管理。

参考文献

[1]Shiou-Hwei Yeh,Chiao-Ling Li,You-Yu Lin,Ming-Chih Ho,Ya-Chun Wang,Sheng-Tai Tseng,Pei-Jer Chen.Hepatitis B Virus DNA Integration Drives Carcinogenesis and Provides a New Biomarker for HBV-related HCC.Cell Mol Gastroenterol Hepatol.2023;15:921–929.https://doi.org/10.1016/j.jcmgh.2023.01.001